Desarrollo y validaci n de m todo cromatogr fico para la detecci n y cuantificaci n de residuos de Ivermectina en agua residual

Development and validation of a chromatographic method for the detection and quantification of Ivermectin residues in wastewater

Desenvolvimento e valida o de um m todo cromatogr fico para a dete o e quantifica o de res duos de Ivermectina em guas residuais

Elvis Jack Colque-Ayma[1],^2*, Donald Efrain Merma-Chacca1,[2] Alejandro Manuel Ecos-Espino^1,[3] Clara Nely Campos-Quir z^2,3 Jos Luis Ramos-Tejada^1,2 Anyela Pierina Veja-Quispe¹, Franz Zirena-Vilca^1,2

DOI: https://doi.org/10.55996/dekamuagropec.v4i2.192

RESUMEN

Este estudio desarroll y valid un m todo de an lisis por UHPL-DAD para detectar y cuantificar residuos de Ivermectina (IVM) en agua residual. La implementaci n de este m todo, consisti en poder realizar un m todo robusto y eficiente; donde el tiempo de retenci n para este residuo en menci n fue de 3.1 min. No obstante, los par metros considerados en el proceso de validaci n del m todo anal tico fueron: selectividad, linealidad, l mite de detecci n, l mite de cuantificaci n y porcentaje de recuperaci n; el m todo es selectivo, el coeficiente de correlaci n es R² ≥ 0,99, presenta un l mite de detecci n (LD) de 0,003 g L^-1, un l mite de cuantificaci n (LQ) de 0,01 g L^-1, y un porcentaje de recuperaci n del 90% (con fortificaci n de 0,1 g L^-1).

Palabras claves: Validaci n, Antiparasitario, Ivermectina, Cromat grafo, Cuantificaci n.

ABSTRACT

This study developed and validated a method of analysis by UHPL-DAD to detect and quantify Ivermectin (IVM) residues in wastewater. The implementation of this method consisted of a robust and efficient method, where the retention time for this residue was 3.1 min. However, the parameters considered in the validation process of the analytical method were: selectivity, linearity, detection limit, quantification limit and recovery percentage; the method is selective, the correlation coefficient is R² ≥ 0.99, it presents a detection limit (LD) of 0.003 g L^-1, a quantification limit (LQ) of 0.01 g L^-1, and a recovery percentage of 90% (with fortification of 0.1 g L^-1).

Keywords: Validation, Antiparasitic, Ivermectin, Chromatograph, Quantification.

RESUMO

Este estudo desenvolveu e validou um m todo de an lise por UHPL-DAD para detectar e quantificar res duos de Ivermectina (IVM) em guas residuais. A implementa o deste m todo consistiu num m todo robusto e eficiente, onde o tempo de reten o para este res duo foi de 3,1 min. No entanto, os par metros considerados no processo de valida o do m todo anal tico foram: seletividade, linearidade, limite de dete o, limite de quantifica o e percentagem de recupera o; o m todo seletivo, o coeficiente de correla o R2 ≥ 0,99, apresenta um limite de dete o (LD) de 0,003 g L^-1, um limite de quantifica o (LQ) de 0,01 g L^-1, e uma percentagem de recupera o de 90% (com fortifica o de 0,1 g L^-1).

Palavras-chave: Valida o, Antiparasit rio, Ivermectina, Cromat grafo, Quantifica

INTRODUCCI N

El inicio de la pandemia COVID-19, tuvo lugar a principios de 2020 y este se propag de manera muy r pida. Increment ndose as los casos confirmados y un alto n mero de fallecimientos como consecuencia de esta pandemia (Elsaid et al., 2021). Frente a este problema de salud p blica, comenzaron a surgir una serie de medicamentos con capacidad de contrarrestar dicho mal (Chedid et al., 2021). Es relevante se alar que, en esta lista se incluyeron medicamentos que podr an mostrar eficacia contra el COVID-19, como la Ivermectina, la cual ha recibido la aprobaci n de la FDA (Administraci n de Alimentos y Medicamentos) como un antiparasitario para uso solo en animales. Dicho ello, gran parte de este antiparasitarios es utilizado en pa ses europeos y es relevante observar que estos pa ses han continuado utilizando una cantidad significativa de antibi ticos durante un extenso per odo de tiempo, tal como lo indican los datos proporcionados por el Centro Europeo para la Prevenci n y el Control de Enfermedades (ECDC) (Ammon, 2020).

Indudablemente, se desencaden una crisis sin precedentes que afect significativamente a los sistemas de atenci n m dica y a los recursos en varias partes del mundo; subrayando as la relevancia de tomar medidas preventivas y de control de infecciones; y como consecuencia de estas medidas, los pacientes se ve an m s expuestos (Rawson et al., 2020). Por otro lado, se not un incremento en la cantidad de reportes que registran los efectos en la angustia psicol gicas en las personas; y en donde los s ntomas m s frecuentes incluyen ansiedad, depresi n y estr s, lo cual podr a conducir a la automedicaci n (Gras et al., 2020). Por otro lado, la Ivermectina se clasifica como uno de los medicamentos de amplio espectro y es aprobado para consumo de personas. De modo que, es muy probable que estos residuos tiendan a parar en ltimas instancias a las redes sanitarias (Koch et al., 2005). De hecho, en la actualidad se informa sobre la detecci n de estos residuos, lo que lleva a la identificaci n de sus efectos ecotoxicol gicos en cuerpos de agua superficiales como r os y tambi n en aguas subterr neas (Nieto-Ju rez et al., 2021).

La sobrecarga en el consumo de medicamentos es evidente, lo que incrementa la posibilidad de que los residuos de estos f rmacos lleguen a las plantas de tratamiento de aguas residuales (PTARs), transform ndolas en fuentes de propagaci n de contaminantes emergentes. No obstante, la limitada tecnolog a utilizada en varios pa ses suele afectar la capacidad para eliminar estos contaminantes de manera efectiva (Pazda et al., 2019) y como resultado, provocando la acumulaci n en los lodos y sedimentos (Hiller et al., 2019). Adem s, cantidades considerables a n contin a siendo liberados en los sistemas de alcantarillado antes de llegar a las PTARs; y que a ra z de los sistemas tecnol gicos actuales tienden a no ser eficientes en la eliminaci n de estos compuestos, lo que resulta en una preocupante presi n sobre los cuerpos de agua receptores, generando as una seria amenaza para la salud de las personas y el ambiente. Es por ello que, se desarroll y valid un m todo de an lisis cromatogr fico para detectar y cuantificar residuos de Ivermectina.

MATERIALES Y M TODOS

Se emple un reactivo patr n de la marca Sigma Aldrich con una pureza del 99.9 % para llevar a cabo la identificaci n del antiparasitario. Los an lisis se ejecutaron utilizando un sistema UHPLC (Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.), el cual se encuentra equipado con una bomba anal tica cuaternaria de serie 1290 (Flexible Pump) dem s, se emple un muestreador autom tico 1290 Infinity dise ado para manejar vol menes de hasta 900 mL, junto con un horno de columna de la serie 1200 y una v lvula de conmutaci n de 10 puertas. Tambi n se aplic un procedimiento de carga de muestra que implic el uso de una columna anal tica C18 de dimensiones 150 mm x 2.1 mm x 1,9 m, colocada a 35 C. Se aplic una fase m vil en proporci n 70:20:10 (A / B / C), que consiste en acetonitrilo (solvente A), agua (solvente B) y metanol (solvente C) en modo isocr tico. Se estableci un caudal de 0.6 mL por minuto a una temperatura de 35 C utilizando una bomba anal tica. Se inyect una muestra de 10 L y se mantuvo una presi n aproximada de 600 bar con una longitud de onda de detecci n de 245.4 nm (Monteiro et al., 2015).

Se elabor una curva de calibraci n utilizando concentraciones de 0.01, 0.5, 1, 2 y 4 g mL^-1 de Ivermectina, con un coeficiente de determinaci n (r²) superior a 0.99, la determinaci n de los l mites de detecci n y cuantificaci n se bas en la relaci n se al-ruido. Se obtuvo un porcentaje de recuperaci n del 90%, similar al obtenido en la prueba de repetibilidad realizada una semana despu s, que fue del 92%. Estos resultados cumplen con los est ndares de an lisis para antibi ticos seg n el Instituto Nacional de Metrolog a y Tecnolog a de Calidad (Anal ticos,2020).

Seguidamente se emple agua de r o como muestra en blanco y, adem s, para llevar a cabo los procedimientos de recuperaci n. Estas muestras de agua se sometieron a un proceso de filtrado a trav s de filtros de fibra de vidrio de 0.45 m, con el fin de eliminar las part culas en suspensi n m s grandes y prevenir cualquier obstrucci n durante la extracci n en fase s lida (SPE) (Cristina & Fontes, 2010). Las extracciones se llevaron a cabo utilizando cartuchos C18 (500 mg, 3 mL, 60 A), los cuales se acondicionaron con 10 mL de metanol seguido de 10 mL de agua ultrapura. Luego, la muestra de agua residual se pas a trav s de los cartuchos a una velocidad de 3 mL por minuto. Para mejorar este proceso de extracci n, se utiliz una bomba perist ltica de la marca Ismatec IPC 932D y una bomba de vac o de la marca Marathon. Despu s de pasar toda la muestra por el cartucho C18, se procedi a eluir con 10 mL de metanol y se transfiri a tubos de ensayo. Luego, se evapor el solvente utilizando nitr geno. Una vez evaporado, se volvi a suspender en 1 mL de acetonitrilo despu s de pasar por una filtraci n mediante filtros de fibra de vidrio de 0.2 m. Finalmente, estas muestras se analizaron en un sistema UHPLC-DAD (Xu et al., 2014).

RESULTADOS

En t rminos de la validaci n, se emple una columna Infinitylab poroshell C18 (Octadecilsilano) (Tabla 1). Instalado en un sistema UHPLC-DAD una columna Infinitylab poroshell C18. La fase m vil utilizada fue una mezcla isocr tica de acetonitrilo (70%), metanol (10%), y agua ultrapura (20%) a un caudal de 0.6 mL/min. De acuerdo con las condiciones cromatogr ficas establecidas en el m todo actual (Tabla 1), se observa una se al anal tica de la Ivermectina a los 3.1 minutos. Es importante destacar que la validaci n se llev a cabo siguiendo las pautas de la gu a DOQ-CGCRE-008, que incluyen criterios de selectividad, linealidad, l mite de detecci n, l mite de cuantificaci n y porcentaje de recuperaci n. Este ltimo se determin utilizando la metodolog a de extracci n en fase s lida (SPE).

Tabla 1. Caracter sticas del m todo para UHPLC-DAD

CARACTERISTICAS	COLUMNA COMATOGR FICA
	C18 (Octadecilsilano)
Dimensiones	2.1 x 150 mm
Di metro de part cula	1.9 μm
Presi n aprox.	600 bar
Volumen de muestra	10 μL
Temperatura utilizada	35 C
Solventes	MEOH ACN H2O (10-70-20 %)

Adem s, la validaci n se llev a cabo siguiendo los criterios de la normativa DOQ-CGCRE-008, en la que se estableci la sensibilidad del m todo en funci n del l mite de detecci n (LOD). El LOD se defini como la concentraci n m nima detectable mediante una relaci n se al-ruido (S/N = 3) (Ribani et al., 2004), el cual nos otorg un resultado de 0.003 μg L^-1. Asimismo, el l mite de cuantificaci n definido por una relaci n se al-ruido de 10 (S/N = 10), permiti una cuantificaci n a partir de 0.01 μg L^-1. As como tambi n se obtuvo un porcentaje de recuperaci n del 90%, lo cual cumple con los criterios establecidos, que se encuentran en el rango del 60 al 120% (Anal ticos, 2020).

Tabla 2. Caracter sticas anal ticas del antiparasitario estudiado en UHPLC

Compuesto	TR	LOD	LOQ	Ecuaci n	Cod	rea de recuperaci n	Rec (%)	SD	CV %
	(min)	( gL^-1)	( gL^-1)
Ivermectina (IVM)	3.1	0.003	0.01	Y = 170.23X+5.7861	A-1	151.8	88.89	0.042	4.64
				R^2= 0.99549	A-2	157.3	92.11
					A-3	142.9	83.67
					A-4	161.3	94.45
					A-5	157.6	92.28

TR: Tiempo de retenci n, LOD: Limite de detecci n, LOQ: Limite de cuantificaci n, SD: desviaci n est ndar, CV: coeficiente de variaci n Rec (%): porcentaje de recuperaci n, R²: coeficiente de Pearson.

Dado los resultados del sistema obtenidos a partir de la curva de calibraci n con concentraciones de: 0.01, 0.5, 1, 2 y 4 g mL^-1 de IVM, y mediante los an lisis respectivos, nos otorg un coeficiente de correlaci n de 0.99549 (Figura 1), mostrando de alguna manera una alta relaci n entre las concentraciones propuestas, los mismos que tambi n, son directamente proporcional al tipo de transformaci n matem tica a aplicar. Cabe mencionar que, la determinaci n de la curva utiliza la relaci n presente entre la respuesta obtenida ( rea de pico cromatogr fico) y la concentraci n del analito de IVM; es as que, dicha estandarizaci n es formulada mediante una expresi n matem tica, el cual sirva para la realizaci n del c lculo de la concentraci n del analito a ser determinado en la muestra.

Figura 1. Correlaci n entre el rea y las concentraciones de preparaciones a distintas concentraciones del analito de IVM.

El resultado obtenido una semana despu s de validar el m todo para poder cumplir con la validaci n de la repetibilidad, bajo un conjunto de condiciones como: el mismo procedimiento de extracci n en fases s lida, el mismo operador, y las mismas condiciones de funcionamiento y mismo equipo; nos dio como resultado una recuperaci n promedio similar, con un porcentaje del 92.39 %. Asimismo, los resultados obtenidos de la desviaci n est ndar en relaci n a la recuperaci n de la fortificaci n (fortificado con 0.1 μg mL^-1) dieron una DESV = 0.041 y un coeficiente de variabilidad de 4.46 % cumpliendo de alguna manera con el procedimiento de Validaci n donde se considera un coeficiente de variabilidad del 20%.

Tabla 3. Repetibilidad del m todo para la recuperaci n de Ivermectina

Compuesto	T.R	Conc.	rea	Ecuaci n de la recta	C digo de muestra	rea de recuperaci n	Recuperaci n de fortificaci n	Porcentaje de recuperaci n (%)	Promedio ()	DESV	CV %
IVM	3.1	1	193.38	Y = 178.31X+5.6337 R^2= 0.9995	B-1	160.7	0.901	90.12	92.39	0.041	4.46
					B-2	167	0.937	93.66
					B-3	154	0.864	86.37
					B-4	171.9	0.964	96.41
					B-5	170.1	0.954	95.4

DISCUSI N

El m todo propuesto, propone algunas ventajas sobre lo desarrollado por (Padivitage et al., 2022; Pawar et al., 2021); esto debido a la obtenci n de un l mite de detecci n (LD) con un valor de 0.003 g L^-1, adem s el l mite de cuantificaci n (LQ) calculado es de 0.01 gL^-1. Demostrando as mayor sensibilidad para este tipo de antiparasitario para an lisis en cuerpos de agua. No obstante, la detecci n se dio en menos tiempo (min 3.1), lo que significar a ahorro en solventes y otros. Por otro lado, se reporta una recuperaci n poco m s del 90 % mediante la aplicaci n de metodolog a de SPE, lo que significar a una similitud en cuanto a lo reportado por Padivitage et al., (2022), quienes a su vez se alan una estabilidad para IVM; a ra z de la persistencia en relaci n a su estabilidad el cual es de 8 d as, a temperaturas de entre (2 y 8 C). Dicho ello, los cambios que se dan despu s de los 7 d as transcurridos (>7 d as); tienden a presentar deformaciones (posible degradaci n) del pico cromatogr fico representativo del analito, lo que m s adelante generar a ciertas alteraciones al momento de realizar los c lculos. Es as que, todo ello recae en la consistencia del mecanismo de retenci n, impacto ambiental y riesgo en el trabajo (Fatoki et al., 2018).

El antiparasitario de la Ivermectina estudiado para ser validado mediante el m todo cromatogr fico acoplado a un sistema UHPLC DAD demostr ser selectivo y especifico. Asimismo, las fases m viles utilizadas durante el proceso de movilidad (ACN - MEOH - H2O) retienen la concentraci n de la Ivermectina, debido a su alta hidrofobicidad que la caracteriza; el mismo que le permite una relaci n oportuna con la fase estacionaria; optimizando de alguna manera la resoluci n del analito mediante un pico cromatogr fico bien definido (Pawar et al., 2021); en ese sentido, la sensibilidad lograda fue lo suficientemente eficiente para detectar tambi n los niveles bajos de Ivermectina.

Las concentraciones utilizadas para la elaboraci n de la curva de calibraci n presentaron un coeficiente de correlaci n de r = 0.995 siendo este mayor a lo esperado el cual fue de 0.99; despejando alg n comportamiento an malo (o resultados at picos) para la IVM durante la recuperaci n y cumpliendo con lo establecido por (Anal ticos, 2020). De hecho, la data obtenida para esta validaci n es mejor o igual que lo obtenido por Pawar et al. (2021). Asimismo, los resultados muestran un coeficiente de correlaci n eficiente para este m todo; en donde cuyas concentraciones tomadas para la elaboraci n de la curva de calibraci n son de 0.01, 0.5, 1, 2 y 4 g mL^-1 respectivamente.

CONCLUSIONES

El m todo desarrollado y validado para la detecci n y cuantificaci n de residuo de ivermectina se realiz por UHPL-DAD, presenta un l mite de detecci n y cuantificaci n de 0.003 y 0.01 μg L^-1 respectivamente, con un coeficiente de correlaci n r² > 0.99 y con un porcentaje de recuperaci n 90.28 %, estos valores se encuentran dentro de los par metros establecidos en el DOQ-CGCRE-008. Estas cualidades la convierten en una opci n apropiada y fiable para el prop sito deseado. No obstante, la metodolog a que se describe es sencilla y se ejecuta en un per odo de tiempo adecuado en comparaci n con otras t cnicas mencionadas en la literatura. Adem s, la fase m vil utilizada es menos agresiva para la fase estacionaria, lo que mejora su respuesta en el tiempo de retenci n. La metodolog a validada permite la detecci n de este antiparasitario y puede aplicarse igualmente para la identificaci n en fuentes de aguas superficiales.

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[1] Escuela profesional de Ingenier a Ambiental de la Universidad Nacional de Moquegua, Per ; correo colqueaymajack@gmail.com, donald.merma@gmail.com, jramost@unam.edu.pe, anyelapierina_2000_15@hotmail.com

[2] Laboratorio de Contaminantes Org nicos y Ambiente del IINDEP de la Universidad Nacional de Moquegua, Per . Correo: claracampos23@gmail.com, fzirenav@unam.edu.pe

[3] SAMYECO S.R.L. Urb. Las Terrazas, Mz I lote 30, Pacocha-Ilo, Per . claracampos23@gmail.com